Курсовая работа : Креатинфосфокиназа 


Полнотекстовый поиск по базе:

Главная >> Курсовая работа >> Биология


Креатинфосфокиназа




ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. Г. БЕЛИНСКОГО

Факультет

естественно-географический Кафедра биохимии





КУРСОВАЯ РАБОТА

«Креатинфосфокиназа»

Выполнил: студентка гр. БХ-31

Юматова Екатерина

Преподаватель: Соловьев В. Б.

Пенза, 2009

Содержание

Введение

Классификация

Изоферменты креатинфосфокиназы

Диагностическое значение исследования активности изоферментов КФК

Методы определения активности КФК

Стандартные клинико-лабораторные показатели

Роль креатинфосфокиназы в метаболизме мышечной ткани

Кинетика действия КФК

Перенос энергии из митохондрий в цитоплазму клетки миокарда с помощью изоферментов КФК

Активность КФК в мембранах саркоплазматического ретикулума миокарда в условиях экспериментальной коронарной недостаточности

Влияние алкогольной интоксикации и процессов старения на активность креатинфосфокиназы и ее ферментов

Заключение

Список литературы

Введение

История изучения креатинфосфокиназы (КФК) интересна и необычна: несмотря на то, что она началась более 80 лет тому назад (с открытия креатинфосфата в 1927 г.), а креатинкиназная реакция была открыта Ломаном и Леманом в 1934- 1936 годах, исследователи все еще открывают новые функции креатинкиназной системы и проблема остается далекой от разрешения. Развитие идей о физиологической роли креатинкиназной системы с самого начала было тесно связано с успехами в области изучения мышечной физиологии и биоэнергетики. Со своей стороны, исследования креатинкиназной системы вносят заметный вклад в формирование представлений об общих принципах организации метаболизма и метаболического контроля в клетке.

Цель работы: исследование современных взглядов на строение и биологическую роль креатинфосфокиназы.

Классификация

Креатинкиназа (КФ 2. 7. 3. 2) – относится к фосфотрансферазам с азотсодержащей группой в качестве акцептора.

К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие различные превращения, представляющие собой перенос радикала от молекулы-донора к молекуле-акцептору и не являющиеся процессом гидролиза. Наименование их составляется по форме: «донор – транспортируемая группа – трансфераза».

Креатинфосфокиназа относится к одному из самых больших подклассов трансфераз – киназам – ферментам, катализирующим перенос остатков фосфорной кислоты, ее ангидридов и эфиров (подкласс 2.7). Креатинкиназа обладает узкой субстратной специфичностью. (Кнооре Д. Г., Биологическая химия, М., 2000, с. 135, 137, 229).

Изоферменты креатинфосфокиназы

В 1964 г. были открыты изоферменты креатинфосфокиназы: цитоплазматические ВВ-КФК (от англ. brain – мозг), ММ-КФК (от англ. muscle – мышца) и гибридная форма - МВ-КФК, а также митохондриальный изофермент – мт-КФК.

В сердце цитоплазма содержит половину ММ-формы, а также всю МВ- и ВВ-КФК; их суммарная активность составляет 40-50% от общей активности.

В скелетных мышцах, где содержание митохондрии невелико, на их долю приходится только 2,5-6 % от общей активности КФК, хотя удельная активность мт-КФК в скелетных мышцах не ниже, чем в сердце.

В миофибриллах сердца и скелетных мышц млекопитающих ММ-КФК является интегральной частью М-линии; в скелетных мышцах на долю этой КФК приходится 5% от общей активности фермента, а большая часть остальной активности присутствует в цитоплазме. (Липская Т. Ю. Физиологическая роль креатинкиназной системы: эволюция представлений, М., 2001).

Диагностическое значение исследования активности изоферментов КФК

Исследование активности изоферментов КФК в сыворотке крови имеет важное диагностическое значение. Изоферменты креатинкиназы особо важно исследовать при остром инфаркте миокарда, так как МВ-форма в значительном количестве содержится практически только в сердечной мышце. Повышение активности МВ-формы в сыворотке крови свидетельствует о поражении именно сердечной мышцы.

Возрастание активности ферментов сыворотки крови при многих патологических процессах объясняется, прежде всего, двумя причинами: 1) выходом в кровяное русло ферментов из поврежденных участков органов или тканей на фоне продолжающегося их биосинтеза в поврежденных тканях; 2) одновременным повышением каталитической активности некоторых ферментов, переходящих в кровь. Возможно, что повышение активности ферментов при «поломке» механизмов внутриклеточной регуляции обмена веществ связано с прекращением действия соответствующих регуляторов и ингибиторов ферментов, изменением под влиянием различных факторов строения и структуры макромолекул ферментов. (Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф., Биологическая химия, М., 1998, с. 580).

Методы определения активности КФК

Унифицированным методом определения активности креатинфосфокиназы служит метод с использованием в качестве субстрата реакции креатина. Активность фермента пропорциональна количеству неорганического фосфора, образующегося в результате кислотного гидролиза продукта креатинкиназной реакции – креатинфосфата. Неорганический фосфор определяется по цветной реакции с молибдатом аммония. В норме активность креатинкиназы в крови, установленная с помощью этого метода, достигает 100 нмоль/(с*л), или до 6 МЕ. Активность МВ-формы креатинкиназы составляет менее 2 % от общей активности фермента. Вторым методом определения активности креатинкиназы, также принятым в качестве унифицированного, является метод с использованием в качестве субстрата креатинфосфата. Активность фермента пропорциональна количеству креатина, образующегося в результате ферментативной реакции. Креатин определяется по цветной реакции с -нафтолом. В норме активность креатинкиназы в сыворотке крови, установленная с помощью этого метода, составляет от 0 до 220 нмоль/(с*л), или от 0 до 13 МЕ [Международная единица = 16,67 нмоль/(с*л)]. (Ленинджер А., Биохимия, М., 1976, с. 382).

Стандартные клинико-лабораторные показатели

Креатинфосфокиназа (КФК) в сыворотке

Норма: 10-50 МЕ/л при 30С0 (варьирует в зависимости от метода определения).

А. Предосторожности при проведении опыта: фермент нестабилен, содержимое эритроцитов ингибирует активность фермента. Сыворотка должна быть быстро отделена от сгустка. Если исследование не может быть произведено немедленно, сыворотку следует заморозить.

Б. Физиологическая основа: КФК расщепляет креатинфосфат (при участии АДФ) с образованием креатина и АТФ. КФК много в скелетной и сердечной мышцах, в мозге.

В. Интерпретация полученных данных:

Повышение показателя имеет место при мышечных нарушениях (инфаркт миокарда, травма мышцы), при мышечной дистрофии, полимиозите, сильном мышечном напряжении (беге), гипотиреозе, инсульте. После инфаркта миокарда КФК повышается быстро (за 3-5 часов) и сохранятся повышенной 2-3 дня.

Показатель не повышается при инфаркте легкого или поражении паренхимы печени.

Изоферменты креатинфосфокиназы в сыворотке (таблица №1)

А. Предосторожности при проведении опыта: такие же, как и в случае исследования КФК (см. выше).

Б. Физиологическая основа: КФК представлена тремя изоферментами, разделяющимися при электрофорезе. Для скелетной мышцы характерен изофермент ММ, для миокарда МВ, для мозга – ВВ.

В. Интерпретация полученных данных: Содержание КФК-ММ повышается при повреждении скелетных мышц, мышцы сердца, мозга; при заболеваниях мышц (дистрофия, гипотиреоз, дерматомиозит, полимиозит); при рабдомиолизе; после тяжелой физической нагрузки. Содержание КФК-МВ повышается сразу после инфаркта миокарда (в течение 2-4 часов) и сохраняется повышенным до 72 часов; при тяжелом поражении мышц; синдроме Рейе; при пятнистой лихорадке Скалистых гор. Уровень КФК-ВВ иногда повышается при тяжелом шоке; при некоторых карциномах (особенно при овсяноклеточной карциноме, а также карциноме яичников, молочной железы или простаты) или при атрезии желчных протоков.

Таблица №1. Изоферменты креатинфосфокиназы

Изоферменты

Нормальный уровень (% от общего)

Наиболее быстрый

Фракция 1, ВВ

0

Фракция 2, МВ

0-3

Наиболее медленный

Фракция 3, ММ

97-100

( Марри Р., Биохимия человека, Т.2, М.,1993, с. 372, 373).

Роль креатинфосфокиназы в метаболизме мышечной ткани

АТФ, необходимый в качестве постоянного источника энергии для мышечного цикла сокращение-расслабление, может образовываться засчет гликолиза, окислительного фосфорилирования, креатинфосфата или двух молекул АДФ. Запасы АТФ в скелетной мышце при сокращении быстро истощаются, и их хватает менее чем на секундное сокращение. В медленных скелетных мышцах, обладающих значительными резервами О2 в миоглобине, основной источник регенерации АТФ – окислительное фосфорилирование. Быстрые скелетные мышцы регенирируют АТФ главным образом в ходе гликолиза.

Фосфагены, такие как креатинфосфат, предотвращают быстрое истощение запасов АТФ, поставляя легко используемый макроэргический фосфат, необходимый для ресинтеза АТФ из АДФ. Креатинфосфат образуется из АТФ и креатина в период расслабления мышцы, когда потребность в АТФ не столь велика. Фосфорилирование креатина катализируется креатинфосфокиназой – специфичным для мышц ферментом. ( Марри Р., Биохимия человека, Т.2, М.,1993, с. 340, 341).

Кинетика действия КФК

Креатинфосфокиназа функционирует по неупорядоченному равновесному механизму.

Этот механизм может быть представлен следующей схемой:

(1)

где стадия, характеризующаяся константой k, является лимитирующей.

Для четырех равновесных реакций

Е + А  ЕА, (2)

Е + В  ЕВ, (3)

ЕА + В  ЕАВ, (4)

ЕВ + А  ЕАВ, (5)

получаем четыре уравнения

(e – xa – xb – x)a = KSAxa , (6)

(e – xa – xb – x)b = KSBxb , (7)

xab = KMBx , (8)

xba = KMAx , (9)

где а, b, x, xa, xb – концентрации соответственно А, В, ЕАВ, ЕА и ЕВ; KSA, KSB, KMA, KMB – константы диссоциации четырех равновесных реакций. Скорость суммарной реакции пропорциональна концентрации ЕАВ. Таким образом,

V = kx. (10)

Исключая х из приведенных выше уравнений, получаем:

Это уравнение содержит только три из четырех констант равновесия. Четвертая оказывается «излишней», так как она связана с тремя остальными константами соотношением

KSAKMB = KMAKSB (12)

Можно показать, что член ke равен максимальной скорости. При выводе уравнения (11) не было сделано допущения о влиянии, которое может оказывать взаимодействие фермента с одним из субстратов на взаимодействие с другим.

Если каждый субстрат взаимодействует только со своим участком связывания и не оказывает влияния на сродство фермента к другому субстрату, то KSA = KMA и KSB = KMB; уравнение (11) при этом упрощается до

Таким образом, обе константы Михаэлиса можно определить просто путем изменения концентрации одного из субстратов при постоянной концентрации другого. ( Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, Т. 1, М., 1982, с. 134, 135).

Перенос энергии из митохондрий в цитоплазму клетки миокарда с помощью изоферментов КФК



В последнее время появились данные, доказывающие, что креатинфосфат в мышечной ткани (в частности, в сердечной мышце) способен выполнять не только роль депо легкомобилизуемых макроэргических фосфатных групп, но также роль транспортной формы макроэргических фосфатных связей, образующихся в процессе тканевого дыхания и связанного с ним окислительного фосфорилирования. Предложена схема переноса энергии из митохондрий в цитоплазму клетки миокарда (рис. 20.7).

АТФ, синтезированный в матриксе митохондрий, переносится через внутреннюю мембрану с участием специфической АТФ-АДФ-транслоказы на активный центр митохондриального изофермента креатинкиназы, который расположен на внешней стороне внутренней мембраны; в межмембранном пространстве (в присутствии ионов Mg2+) при наличии в среде креатина образуется равновесный тройной фермент-субстратный комплекс креатин–креатинкиназа–АТФ-Mg2+, который затем распадается на креатинфосфат и АДФ Mg2+ . Креатинфосфат диффундирует в цитоплазму, где используется в миофибриллярной креатинкиназной реакции для рефосфорилирования АДФ, образовавшегося при сокращении. Высказываются предположения, что не только в сердечной мышце, но и в скелетной мускулатуре имеется подобный путь транспорта энергии из митохондрий в миофибриллы. (Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф., Биологическая химия, М., 1998, с. 580, 654, 655). Изоферменты КФК обнаружены во всех субклеточных структурах, продуцирующих либо использующих энергию, - в митохондриальной мембране, миофибриллах, мембране саркоплазматического ретикулума (СПР), плазматической клеточной мембране и др. (Фролькис Р. А., Воронков Г. С., Дубур Г. Я., Циомик В. А., Гомон И. В. – Некоторые аспекты изучения активности креатинфосфокиназы в мембранах саркоплазматического ретикулума миокарда в условиях экспериментальной коронарной недостаточности //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, М., 1983, №5, с. 53).

Активность КФК в мембранах саркоплазматического ретикулума миокарда в условиях экспериментальной коронарной недостаточности

Изоферменты КФК находятся в тесном функциональном сопряжении с другими ферментами, обеспечивающими перенос веществ и ионов через мембраны. Так, в митохондриях КФК функционирует в тесном сопряжении с АТФ-АДФ-транслоказой, в миофибриллах, мембране СПР и сарколемме – соответственно с Mg-зависимой, Са-зависимой и Na, К-зависимой АТФ-азой.

Важность изучения роли мембранных образований в процессах транспорта и утилизации энергии клетками миокарда приобретает особое значение в условиях его ишемии, при которой наблюдаются существенные изменения в структуре и свойствах белково-липидного слоя мембран и прежде всего в их фосфолипидном составе. Последнее обстоятельство особенно важно в связи с имеющимися в литературе сведениями о том, что некоторые изоферменты КФК, скорее всего, связываются с мембраной с помощью именно фосфолипидов.

В лаборатории биохимии Украинского НИИ кардиологии им. Н. Д. Стражеско (Киев) и в лаборатории мембраноактивных соединений -дикетонов Института органического синтеза АН Латвийской ССР (Рига) изучали активность митохондриального изофермента КФК при дозированном ограничении коронарного кровотока , а также вопрос об энергообеспечении транспорта Са 2+ через мембраны СПР клеток миокарда и связи этого процесса с некоторыми другими показателями, определяющими функциональное состояние мембранного аппарата СПР.

Опыты проводили на кроликах в условиях острого ограничения коронарного кровотока (внутривенное введение вазопрессина в дозе 0,5 ед/кг), а также на фоне предварительного введения (за 1 ч до вазопрессина) животным антиоксидантного препарата AV-156Na. В мембранах СПР определяли активность КФК, некоторые показатели перекисного окисления липидов, а также содержание фосфолипидов.

Результаты проведенного исследования (таблица №2) свидетельствуют о выраженном влиянии экспериментальной ишемии на все изучаемые звенья метаболизма миокарда. Так, активность изофермента КФК, связанного с мембраной СПР, снижается при вазопрессиновой коронарной недостаточности более чем на 25%.

Таблица №2. Активность КФК, содержание фосфолипидов в мебранах СПР миокарда кроликов при экспериментальной ишемии

Условия опытов

КФК, мкмоль креатинина

на 1мг белка за 1ч

Фосфолипиды,

мкмоль Р на 1 мг белка

Контроль

11,90  0,36

0,37  0,01

Вазопрессин

Вазопрессин на фоне антиоксиданта

8,22  0,10

10,28  0,70

0,22  0,01

0,42  0,01



Сдвиги, обнаруженные со стороны активности КФК, тесно сопряжены со структурными изменениями в мембранах СПР, прежде всего их липидного состава. Так, в условиях коронарной недостаточности наблюдается некоторое снижение содержания мембраносвязанного холестерина, а также резкое падение уровня фосфолипидов (на 40%),

При введении антиоксидантного препарата AV-156Na наблюдалось однонаправленное изменение изучаемых показателей в сторону их нормализации. Этот эффект свидетельствует о том, что уровень протекания перекисных реакций в миокарде во многом определяет характер изменения отдельных метаболических процессов в мембранах.

Обнаруженное снижении активности КФК мембран СПР в условиях экспериментальной ишемии может свидетельствовать об определенном нарушении нормального снабжения энергией транспортной Са-АТФ-азы мембран СПР. При этом изменение активности КФК происходит на фоне значительного снижения в мембранах СПР сердца кроликов уровня фосфолипидов. Возможно, изофермент КФК. Связанный с мембраной СПР, является липидзависимым ферментом и для проявления полной его активности сохранение нормальной липидной структуры мембран – важное и необходимое условие. (Фролькис Р. А., Воронков Г. С. , Дубур Г. Я., Циомик В. А., Гомон И. В. – Некоторые аспекты изучения активности креатинфосфокиназы в мембранах саркоплазматического ретикулума миокарда в условиях экспериментальной коронарной недостаточности //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, М., 1983, №5, с. 53, 54).

Влияние алкогольной интоксикации и процессов старения на активность креатинфосфокиназы и ее изоферментов

В отделе фармакологии Института экспериментальной медицины АМН СССР (Ленинград) проводили опыты по выявлению возрастных изменений активности КФК в сыворотке крови интактных животных в возрасте 4 и 24 месяцев, а также изучали влияние острой алкогольной интоксикации на активность КФК и ее изоферментов в тканях и биологических жидкостях крыс 2 групп: 1) животные в возрасте 4 месяцев, которым за 3 часа до начала эксперимента внутрибрюшинно вводили 25% раствор этанола в дозе 3 и 5 г/кг; 2) контроль – крысы, которым вводили соответствующие объемы физиологического раствора. Перед декапитацией у этих животных под легким эфирным наркозом брали ликвор. В экстракте головного мозга, полученном из коры больших полушарий, ликворе и сыворотке крови определяли активность КФК и ее изоферментный профиль. Общую активность фермента определяли колориметрическим методом. Изоферменты разделяли с помощью хроматографии на колонке на сефадексе ДЕАЕ А50. Количество белка определяли микробиуретовым методом. Статическую обработку проводили по Стьюденту.

Анализируя данные об общей активности КФК в сыворотке крови крыс с острой алкогольной интоксикацией, а также у интактных крыс разного возраста, можно сделать вывод о том, что интактные животные в возрасте 4-5 месяцев по активности КФК и ее изоферментному спектру резко отличаются от интактных крыс в возрасте 24 месяцев (таблица №3).

Таблица №3.Общая активность КФК в сыворотке крови крыс различного возраста и крыс с острой алкогольной интоксикацией

Группа животных

Активность КФК в сыворотке крови, МЕ/л

Интактные крысы в возрасте 4 мес. (n = 12)

2000  90

Интактные крысы в возрасте 24 мес. (n = 8)

750  130

Интактные крысы в возрасте 4 мес. + физиологический раствор (n = 12)

2100  110

Введение этанола:

В дозе 3 г/кг (n = 12)

3300  120

В дозе 5 г/кг (n = 12)

5400  170



Наблюдаемый факт возрастного снижения общей активности КФК в крови, возможно, является следствием изменения уровня общего метаболизма, замедления процессов обновления тканей, уменьшения двигательной активности и т. д.

При введении этанола в дозе 3 г/кг, общая активность в крови резко увеличивается за счет возрастания активности всех трех форм фермента. Наряду с этим наблюдается резкое изменение процентного содержания изоферментов (рис. 1).

Изоферментный спектр КФК в сыворотке крови крыс разного возраста и крыс с острой алкогольной интоксикацией

Рис. 1. По оси абсцисс – изоферментные профили различных групп крыс. А – интактные крысы в возрасте 4 мес., Б – интактные крысы в возрасте 24 мес., В – интактные крысы в возрасте 4 мес. + острая алкогольная интоксикация. 1 – ММ-изофермент КФК, 2 – МВ-изофермент КФК, 3 – ВВ-изофермент КФК. По оси ординат – содержание изоферментов КФК в крови (в %).



Эти данные свидетельствуют о том, что этанол вызывает структурные повреждения мембран клеток на уровне всего организма, мозг и миокард страдают при этом более всего, так как абсолютный прирост активности для МВ- и ВВ-изоферментов наибольший. (в 4 и 10 раз соответственно), в то время как активность ММ-КФК увеличивается всего в 1,4 раза. Можно предположить, что источником сывороточной активности ВВ-КФК является ткань мозга. Для проверки этого предположения была изучена динамика активности КФК в системе мозг – ликвор – кровь (таблица №4).

Таблица №4. Активность КФК в головном мозге, ликворе и сыворотке крови крыс при острой алкогольной интоксикации (n=12)

Условия опыта

Мозг, МЕ на 1 мг белка

Ликвор, МЕ/л

Сыворотка крови, МЕ/л

Контроль (физиологический раствор)

9,20 ± 0,12

25 ± 4

2100 ± 110

Введение этанола:

В дозе 3 г/кг

8,01 ±0,10

430 ± 58

3300 ± 120

В дозе 5 г/кг

6,90 ± 0.15

1015 ± 120

5310 ± 172

Активность КФК при введении этанола крысам, снижается в мозге, а в ликворе и крови увеличивается, причем данные измерения носят дозозависимый характер. Это позволяет говорить о том, что под действием острой алкогольной интоксикации нарушается проницаемость гематоэнцефалического барьера и клеток коры головного мозга, в результате чего становится возможной утечка глобулярного белка КФК из цитоплазмы клеток в ликвор, а затем в кровь, что и может приводить к изменению содержания ВВ-изофермента в крови. (Чуваев И. В. – Характеристика изоферментного спектра креатинкиназы в сыворотке крови крыс при старении и острой алкогольной интоксикации //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, М., 1993, №12, с. 390, 391).



Заключение

Креатинфосфокиназа - ключевой фермент биосинтеза макроэргического субстрата - креатинфосфата, играющего наряду с АТФ выдающуюся роль в биоэнергетике сердечной мышцы и всего организма.

Определение активности креатинкиназы служит ценным диагностическим тестом при инфаркте миокарда и других патологиях. На основании последовательных измерений активности креатинкиназы в сыворотке крови можно судить о степени некротического процесса в миокарде и оценить эффективность проводимой терапии.

Но не все аспекты функций креатинфосфокиназы изучены. Важная информация может быть получена при изучении креатинкиназной системы в мозге, КФК цитоплазмы и митохондрий которого представлена иными, чем в мышцах, изоформами, а также в мышечных клетках разных видов животных, стоящих на разных ступенях эволюции; при разных патологических состояниях.

Список литературы

  1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия, М., 1998.

  2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, Т. 1, М., 1982.

  3. Кнооре Д. Г. Биологическая химия, М., 2000.

  4. Ленинджер А., Биохимия, М., 1976.

  5. Липская Т. Ю. Физиологическая роль креатинкиназной системы: эволюция представлений, М., 2001.

  6. Марри Р., Биохимия человека, Т. 2, М., 1993.

  7. Фролькис Р. А., Воронков Г. С., Дубур Г. Я., Циомик В. А., Гомон И. В. Некоторые аспекты изучения активности креатинфосфокиназы в мембранах саркоплазматического ретикулума миокарда в условиях экспериментальной коронарной недостаточности //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины №5, М., 1983.

  8. Чуваев И. В. Характеристика изоферментного спектра креатинкиназы в сыворотке крови крыс при старении и острой алкогольной интоксикации //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины №4, М., 1991.

Похожие работы: